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2014诺贝尔化学奖的遗珠:结构光照明显微法

2020-06-04


2014諾貝爾化學獎的遺珠:結構光照明顯微法

2014年诺贝尔化学奖颁给了「超高解析萤光显微法」的开发者,得奖的显微法包括 「受激放射消去显微法」 (STED microscopy) 以及「光启动定位显微法」 (PALM)。然而,从事生物影像相关研究者应该大致上都同意在此二技术之外应还有一种超高解析显微法 ─「结构光照明显微法」 (SIM, structured-illumination microscopy) 也有资格同获这顶诺贝尔桂冠。本文即将介绍此一技术的原理机制,以及为何此一技术最终与此顶诺贝尔桂冠无缘。

「结构光照明显微法」主要研发者是美国 Janelia Farm 的 Mats Gustafsson博士 1,2。此一技术顾名思义即是藉由特定图形的光(a defined illumination pattern,通常为一可由两道光相互干涉(interference)所形成的正弦波栅状结构)去照射欲观测的样本,进而得到超越一般光学解析度的影像(见图一)。

2014诺贝尔化学奖的遗珠:结构光照明显微法

图一、当某一任意样本的细微结构被此具特定图形的光照明后,光的图形受样本结构的图形影响,产生一个新的干涉图样,称之为「莫而干涉纹」或「叠纹图样」 (Moiré pattern)。 a. 某特定未知的样本之细纹结构。b.照明光的图形(pattern)。c. b照射a得到的干涉叠纹图样。(图片来源:取自参考资料2)

如图一所示,当某一任意样本的细微结构被此具特定图形的光照明后,光的图形受样本结构的图形影响,产生一个新的干涉图样,称之为「莫而干涉纹」或「叠纹图样」 (Moiré pattern)。此时,由于此叠纹图样中的照明光图形为已知,我们便可经由傅立叶转换回推出未知样本的部份构造资讯。借由此种手法,针对一般光学解析度以下而无法呈象的细微构造,我们也可以利用此显微方法,从最后的干涉图形去推定观测样本的可能细微结构。

然而,由于照明结构的图纹同样会遮蔽部份的样本讯息,要以此一技术取得完整的样本构造则必须要扫动照明结构以重建完整的样本构造。当照明为如图一所示的正弦波栅状结构时,将该栅状结构往垂直于栅栏条纹的方向扫1/3栅栏间隔的距离三次(以正弦波的角度来说为120° × 3)后即可获得完整的样本情报,而垂直于栅栏条纹的方向的细微样本构造亦能被解析出来。若欲解析样本的完整细微构造,除了单方向扫描照设结构外也必须同时旋转照明构造以取得多方向的样本结构情报。一般来说旋转也是分做 120° 转三次完成一周。在经过如此三方向三阶段、共九张图的扫描后,我们即可得到含有完整超越一般光学解析度的样本情报(图二及图三)。

2014诺贝尔化学奖的遗珠:结构光照明显微法

图二、 a.某任意显微镜影像经傅立叶转换后得到的图像。b. 同一影像经结构照明后再傅立叶转换所得的图像。白色箭头所指处为经结构照明后所得的新情报。c. 将照明结构120°旋转三次并各三阶段扫瞄后所重建出的七组傅立叶转换图像〈位于中心的影像在前述操作过程中会重覆三次,因此只有七组影像〉。d. 将重建所得的七组影像小心重叠后所能建构出的、内含比初始影像〈图a〉更多情报的结构光照明傅立叶转换图像。仔细比较即可发现图d有讯号的範围比图a广,在反傅立叶转换后这些较图a延伸出去的讯号即可重建较最初始影像更细节、原本藏在绕射极限之下的构造情报。(图片来源:取自参考资料1)

2014诺贝尔化学奖的遗珠:结构光照明显微法

图三、 b. a. 细胞中肌动蛋白丝的普通显微法影像。b. 经结构光照明并傅立叶转换重建后的结构光照明显微法影像。c. 和 d. 分别为 a. 和 b. 中方框区域的放大图。很明显经过结构光照明显微法呈像后解析度有十足地进步。(图片来源:取自参考资料1)

由于此一显微法不需要极强的入射光,其造成的样本损伤远小于去年获奖的两种技术,因此很快便被更广泛地引入各式生物呈像学研究。不过严格来说,上述的方法仍受限于光的绕射而仅能改善解析度至原本的绕射极限一半左右的大小,因而还不足以称作真正地超高解析显微法。直到 2005 年, Mats Gustafsson 利用萤光饱和的原理开发了「饱和结构光照明显微法」 (Saturated structured-illumination micriscoy)2 才借由萤光分子的饱和反应成功地将「结构光照明显微法」这家族晋升为理论上可解析单一萤光分子的超高解析显微法之一。限于篇幅问题,萤光分子的饱和反应将留待下篇续述。

一直以来 Mats Gustafsson 对超高解析显微法这领域的贡献被视作不下于 Stefan Hell 及 Eric Betzig 二人,可惜 Mats Gustafsson 于 2011 年四月逝于脑癌无缘去年的诺贝尔化学奖。不过诺贝尔委员会在获奖叙述中多次提及 Mats Gustafsson 的名字及其对此一领域的贡献,也可谓是给了他应有的公道。

参考资料



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